血小板功能的檢測包括測定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而，在血小板相關(guān)疾病的診斷中，檢測血小板功能的方法常常是有爭議的。這通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，靜脈阻滯、抗凝劑選擇、離心，甚至標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)纫蛩兀伎蓪?dǎo)致醫(yī)源性血小板激活，影響臨床診斷的價(jià)值。這就要求建立一種靈敏、、快速、簡便，可用于臨床常規(guī)檢測血小板功能測定方法。
 　　由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達(dá)水平的高低來判斷，近年來，文獻(xiàn)報(bào)道利用流式細(xì)胞術(shù)，特別是全血法流式細(xì)胞術(shù)，檢測血小板膜糖蛋白的表達(dá)［2］。該技術(shù)能靈敏、特異地檢測血液中活化血小板，并評(píng)價(jià)其功能?，F(xiàn)就全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板功能的方法及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀和潛力進(jìn)行綜述。
　　一、全血法流式細(xì)胞術(shù)
　　1.方法學(xué)：流式細(xì)胞儀能快速測定大量個(gè)體細(xì)胞的特性。樣品中欲分析的細(xì)胞預(yù)先進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后由壓縮氮經(jīng)硅管送達(dá)標(biāo)本室，再以5 000～10 000個(gè)細(xì)胞/秒的速率逐個(gè)射入光敏感區(qū)。在適當(dāng)波長的激發(fā)光作用下，被特殊染色的細(xì)胞發(fā)射出一定量的熒光脈沖訊號(hào)。探測器收集每個(gè)細(xì)胞的熒光訊號(hào)和光散射，然后傳入計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。
　　傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜糖蛋白的表達(dá)，常用的樣本是經(jīng)洗滌的血小板或富含血小板的血漿。由于血小板極易活化激惹，樣本經(jīng)離心、洗滌等步驟，容易人為地導(dǎo)致體外血小板激活，影響臨床診斷價(jià)值。為此，Shatti等［2］引入了全血法流式細(xì)胞術(shù)。該技術(shù)能使用全血樣本測定循環(huán)中血小板的活化狀態(tài)以及血小板對(duì)激活劑的功能應(yīng)答。
　　全血流式細(xì)胞術(shù)樣本制備步驟為：
　　抽血抗凝→稀釋→生物素化的檢測用單克隆抗體（單抗）→激動(dòng)劑或緩沖液→固定（1%多聚甲醛）→FITC標(biāo)記的鑒別用單抗→PE-卵白素→稀釋。
　　稀釋樣本是為了防止血小板聚集，否則單個(gè)血小板上的抗原量就測不出來了，因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀測定的是單個(gè)粒子的熒光，而不管這單個(gè)粒子是一個(gè)血小板還是幾個(gè)血小板的聚集體。當(dāng)用凝血酶作外源激動(dòng)劑時(shí)，為防止血小板聚集并形成纖維蛋白凝塊，可在全血標(biāo)本中加入四肽化合物Gly-Pro-Arg-Pro （GPRP）［3］。固定這一步若不干擾單抗的結(jié)合，生物素化的檢測用單抗也可以在固定后加入。血小板鑒別用單抗可在針對(duì)血小板特異性膜糖蛋白GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa的單抗中任選一種。標(biāo)記這單抗的熒光試劑可在FITC、PE、PE-CY53種熒光染料中任選。
　　樣本隨后用流式細(xì)胞儀檢測。通過熒光極性和特異性光散射鑒別出血小板后，檢測5 000～10 000個(gè)血小板表面的特異性熒光訊號(hào)。檢測結(jié)果可用兩種方法表示。一種是平均顆粒熒光強(qiáng)度，另一種是特異性熒光抗體結(jié)合陽性血小板的百分率。陽性血小板百分率法與熒光信號(hào)的放大倍數(shù)無關(guān)，且可以檢測受損傷部位血小板亞群的變化。如果檢測的是血小板表面某抗原的總量，則熒光強(qiáng)度法更為適合。譬如，在活化狀態(tài)下，血小板表面GPIb-IX-V復(fù)合物含量比靜息時(shí)低，但降低的幅度小，通常還不足以報(bào)告陰性結(jié)果［4］，這時(shí)用熒光強(qiáng)度法就比陽性血小板百分率法更合適。
　　目前傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)還不能定量分析結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，但Shatti等［2］利用125I和生物素雙標(biāo)記的單抗進(jìn)行研究，以PE-卵白素作為熒光結(jié)合試劑，發(fā)現(xiàn)碘標(biāo)測定的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與熒光強(qiáng)度間有線性關(guān)系。因此，對(duì)于一個(gè)特定的單抗，一旦弄清這一線性關(guān)系，并知道熒光單抗上熒光素與抗體的摩爾比，就能利用流式細(xì)胞儀定量分析該抗體結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。目前有一些商品試劑盒能定量測定結(jié)合到單個(gè)細(xì)胞上的抗體數(shù)目，但乏見用于血小板的報(bào)道。
　　2.優(yōu)缺點(diǎn)：與常規(guī)血小板功能測定法比，全血法流式細(xì)胞術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)。
　　首先，標(biāo)本處理的簡化能避免血小板體外醫(yī)源性激活，并防止血小板亞群丟失；循環(huán)中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞對(duì)血小板的活化有影響，因此本法能在zui接近受檢者體內(nèi)環(huán)境的條件下測定血小板功能。同時(shí)，由于使用了血小板鑒別用單抗，檢測的僅是血小板，而不會(huì)受其它種類細(xì)胞或碎片的干擾，保證了檢測的特異性。其次，在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶體外活化血小板，也常表現(xiàn)為亞群激活；活化血小板表達(dá)CD62等膜糖蛋白也有明顯的異質(zhì)性［5］。本法能靈敏地檢測出少到1%的活化血小板亞群［6］，尤其是能分析單個(gè)或亞群血小板膜上活化標(biāo)志物的變化，使檢測結(jié)果更接近真實(shí)。若同時(shí)使用FITC、PE、PE-CY5 3種熒光染料，本法通過三色標(biāo)志一次能同時(shí)檢測兩個(gè)抗原標(biāo)志物的變化。
　　此外，做一次檢測僅需2 μl血液，這一點(diǎn)，尤其適合于新生兒和血小板減少性疾病患者。本法不使用同位素，沒有放射性污染。　　全血法流式細(xì)胞術(shù)也存在不足之處。譬如，流式細(xì)胞儀價(jià)格高昂，檢測費(fèi)用高，儀器操作復(fù)雜。為了避免體外活化，血樣需在45分鐘內(nèi)處理，不能久置。另外，流式細(xì)胞儀僅檢測循環(huán)中的血小板功能，而β-TG、PF4和TXA2的檢測還能反映血管壁上血小板的活化和新近被清除的血小板。雖然存在著這些不足，但本法仍是血小板功能檢測的突破性進(jìn)展。
　　二、全血中活化血小板的檢測
　　1.血小板特異性膜糖蛋白：本法檢測血小板功能，首先要對(duì)全血中的血小板進(jìn)行特異性熒光標(biāo)記，將血小板與血樣中其他血細(xì)胞區(qū)分開來。針對(duì)血小板表面特異性膜糖蛋白制備的單抗，使血小板特異性標(biāo)記成為可能。血小板膜糖蛋白已被深入研究［7］，表1顯示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在這些膜糖蛋白中，僅在血小板膜表面表達(dá)主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的幾種［8］。根據(jù)這些特異性糖蛋白制備的熒光單抗，能在全血中特異性地識(shí)別血小板，僅給血小板做上熒光標(biāo)記。
表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

膜糖蛋白	基因家族	配基	功能
GPⅠa/Ⅱa	整合素（B1）	膠原	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素（B1）	Fn	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素（B1）	Laminin	粘附
GPⅡb/Ⅲa	整合素（B3）	Fb,vWF,Vn,Fn	聚集
Vn受體	整合素（B3）	Vn,?vWF,?Fn	粘附
GPⅠb/Ⅸ	LRG	vWF，凝血酶	粘附
GPV	LRG	?	凝血酶底物
GPIV		Thrombospodin	粘附
GP53			血小板-粒細(xì)胞
GMP140	選擇素		相互作用

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纖維蛋白原；Fn纖維粘連蛋白；Vn體外粘連蛋；LRG富含亮氨酸家族 　　2.活化血小板的標(biāo)志物：活化血小板與靜息血小板相比，其質(zhì)膜糖蛋白常發(fā)生顯著的變化，這些變化的糖蛋白便成為活化血小板的檢測標(biāo)志物。　　全血法流式細(xì)胞術(shù)也是一種免疫學(xué)方法，活化血小板表面能通過免疫方法檢測的標(biāo)志物可分為三類［9］：*類是血小板顆粒膜上的糖蛋白。血小板被激活時(shí)，其顆粒膜與質(zhì)膜發(fā)生融合，顆粒膜蛋白，如CD62、CD63，在質(zhì)膜上表達(dá)，成為活化血小板的分子標(biāo)志。第二類是血小板質(zhì)膜表面變化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa（CD41/61）的PAC1表位［10］，它僅在血小板活化時(shí)才因構(gòu)象變化而顯露出來。因此，使用這個(gè)表位的熒光單抗，我們能更地在更早階段檢測到血小板的活化。另外，GPIV （CD36）雖然在靜息血小板上也表達(dá)，但活化血小板上表達(dá)量更高［9］；GPIb-IX-V復(fù)合物（CD42）則相反，與靜息血小板相比，活化血小板上表達(dá)量顯著降低［7］。它們都是活化血小板的分子標(biāo)志。第三類是出現(xiàn)在活化血小板上能與血小板表面受體相結(jié)合的一些抗原，包括纖維蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。這些抗原在血小板表面的出現(xiàn)和消失在臨床檢測上也是有意義的?！　〕龣z測免疫性的分子標(biāo)志物外，流式細(xì)胞術(shù)還能檢測一些反映活化血小板功能的非免疫性指標(biāo)。如用Ca2+濃度敏感的熒光染料檢測胞內(nèi)Ca2+流［10］，用能進(jìn)入血小板致密顆粒的熒光染料阿的平來檢測活化血小板的釋放功能［11］等?！　?.單抗的選擇：與血小板有關(guān)的CD單抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61，CD62，CD63 ，CD107a-b等?；罨“宓臋z測需選擇針對(duì)活化血小板標(biāo)志物的CD單抗。表2列舉了活化血小板檢測的一些代表性單抗。